使用高效液相色谱仪时需要注意的问题是什么？

一、样品预处理与进样

• 样品过滤与脱气

• 样品需用 0.22μm 或 0.45μm 滤膜过滤，避免颗粒杂质堵塞色谱柱或进样阀。

• 蛋白质、多糖等生物样品需离心（10000rpm 以上）后取上清，或用固相萃取（SPE）预处理，防止柱效下降。

• 进样量控制

• 进样量不宜超过色谱柱容量（通常≤20μL），避免过载导致峰展宽或拖尾。

• 自动进样器需定期校准针位置，防止进样针磨损或污染。

二、流动相配制与管理

• 溶剂纯度与混合

• 使用 HPLC 级纯溶剂（如甲醇、乙腈），水相需用超纯水（18.2MΩ?cm），避免无机盐或有机物残留。

• 混合流动相时（如甲醇 - 水），需提前超声脱气 10-15 分钟，或使用在线脱气机，防止气泡进入系统导致基线波动。

• pH 值与缓冲液

• 流动相 pH 需控制在色谱柱耐受范围内，超过范围易导致固定相流失。

• 缓冲液（如磷酸盐、乙酸铵）需现配现用，避免长时间放置滋生微生物，使用后及时冲洗系统（如用 10% 甲醇水冲洗 30 分钟）。

三、色谱柱维护与使用

• 柱温与流速控制

• 柱温需稳定（如 30℃±0.5℃），避免温度波动影响保留时间和分离度；流速不宜超过色谱柱最大耐受压力（通常≤400bar），建议从 0.5mL/min 逐步升至目标流速。

• 柱效监测与再生

• 定期用标准品（如甲苯、萘）测试柱效（理论塔板数 N≥5000/m），若柱效下降 50% 以上，需用 10% 甲醇水→纯甲醇→纯乙腈依次冲洗（各 60 分钟）再生，或用专用柱再生试剂。

• 长期不用时，色谱柱需用纯甲醇或乙腈封存，两端密封，避免干燥导致固定相塌陷。

四、仪器操作规范

• 开机与关机顺序

• 开机：先开泵→柱温箱→检测器→工作站，待系统平衡（基线稳定）后再进样；关机：先降流速至 0，用 10% 甲醇水冲洗系统 30 分钟→纯有机相冲洗 15 分钟→关闭各模块。

• 压力异常处理

• 若压力突然升高（如 > 200bar），可能是柱前筛板堵塞或流动相结晶，需逐段排查（泵→进样阀→色谱柱→检测器），用 5% 稀硝酸冲洗堵塞部件（注意避免接触色谱柱）；若压力波动大，检查泵头是否有气泡或柱塞密封圈磨损。

五、检测器维护

• 紫外检测器（UV）

• 避免长时间使用高波长（如 > 400nm）光源，防止氘灯寿命缩短（正常寿命约 2000 小时）；定期用异丙醇冲洗流通池（1mL/min，30 分钟），清除盐结晶或样品残留。

• 荧光检测器（FLD）

• 激发和发射波长需避开流动相吸收范围（如甲醇在 < 200nm 有吸收），样品需避光处理，防止荧光淬灭。

六、日常维护与故障排查

• 泵系统保养

• 每周更换泵头清洗液（10% 异丙醇），每 3 个月更换柱塞密封圈和主动阀密封圈，防止漏液或压力不稳。

• 数据记录与备份

• 分析数据需实时保存，定期备份工作站数据库，避免因软件崩溃导致数据丢失；色谱图需标注样品信息、方法参数（如流动相比例、柱温），便于追溯。

七、安全与环保

• 有机溶剂防护

• 操作时佩戴手套、护目镜，实验室需通风良好，避免乙腈等挥发气体积聚；废液需分类收集（有机相、水相、含酸 / 碱废液），交由专业机构处理。

• 电气安全

• 仪器需接地良好，避免在潮湿环境下操作，维修时断开电源，防止触电。

总结

HPLC 的核心是 “精密控制与细节管理”，从样品前处理到仪器参数设置，每一步均可影响结果的重复性和准确性。定期维护（如每月系统性冲洗系统、半年校准检测器）可显著降低故障率，延长仪器使用寿命。若遇到复杂故障（如色谱柱不可逆污染），建议联系厂商工程师协助处理

如何正确使用液相色谱仪