流式细胞仪的使用操作细节

一、操作前准备

1. 环境与设备检查

• 实验室环境：保持室温20~25℃，湿度40%~70%，避免强光直射和剧烈震动，减少灰尘污染（建议配备空气净化器）。

• 设备外观检查：

  • 确认管路无泄漏、堵塞或老化（尤其是鞘液、废液管路）。

  • 检查激光光源状态（如指示灯是否正常，部分仪器需预热 30 分钟以上）。

  • 确保液流系统（鞘液桶、废液桶）清洁，鞘液需使用超纯水或专用鞘液，且过滤膜定期更换（通常每 1~3 个月一次）。

2. 样本制备

• 单细胞悬液制备：

  • 组织样本需通过酶消化、机械研磨或滤网过滤（推荐 40~70 μm 细胞筛）制成单细胞悬液，避免细胞团块堵塞管路。

  • 血液 / 体液样本需抗凝处理（如 EDTA、肝素），避免细胞凝集。

• 染色要求：

  • 荧光抗体染色需在4℃避光条件下孵育 15~30 分钟，染色后用 PBS 洗涤 2 次，减少非特异性结合。

  • 活细胞染色需注意染料毒性（如 PI 仅用于死细胞染色），染色后尽快上机（建议 1 小时内）。

• 细胞浓度调整：通过血球计数板或自动细胞计数器调整细胞浓度至1×10?~5×10? cells/mL，避免过高浓度导致液流不稳定或管路堵塞。

二、开机与系统校准

1. 开机流程

1. 接通电源，依次开启计算机、流式细胞仪主机、激光器（若为汞灯等需预热）。

2. 启动控制软件（如 FlowJo、BD FACSDiva），连接设备并初始化系统。

3. 运行液流校准程序：

   • 注入鞘液，观察压力值是否稳定（通常为 15~30 psi，依仪器型号而定）。

   • 执行 “液流对齐”（Fluidic Alignment），通过荧光微球（如 Flow Cytometry Standard Beads）调整激光聚焦点，确保单细胞流通过检测区域。

2. 光路校准与补偿设置

• 荧光校准：使用标准荧光微球（如 Calibration Beads）校准各通道荧光强度，确保不同时间点数据的一致性。

• 光谱补偿（Compensation）：

  • 由于荧光染料发射光谱重叠，需通过单染样本（如仅标记 FITC 的细胞）设置补偿参数，消除通道间串扰。

  • 示例：若 FITC 信号漏入 PE 通道，需在软件中调整 “FITC→PE” 补偿值至阴性群体 MFI＜100。

三、样本检测操作

1. 上样与参数设置

• 手动进样：

  • 将样本管放入进样架，选择 “手动模式”，设置流速（低速：≤50 μL/min，高速：≥200 μL/min），推荐低速以减少误差。

  • 丢弃前 200~500 μL 样本（避免气泡和边缘效应），待流式图稳定后开始采集数据。

• 自动进样（如有）：

  • 编辑进样列表，设置样本名称、采集时间（如采集 10,000 个细胞或持续 60 秒），确保样本针位置准确。

• 检测参数设置：

  • 必选参数：前向散射光（FSC，反映细胞大小）、侧向散射光（SSC，反映细胞内部复杂性）、荧光参数（如 FL1~FL4 对应不同染料）。

  • 采集模式：选择 “对数放大”（适用于荧光信号）或 “线性放大”（适用于 FSC/SSC），根据样本特性调整电压（PMT 值），使阴性群体位于荧光轴左侧 1/3 处。

2. 数据采集与监控

• 实时监控：

  • 观察 FSC/SSC 散点图，排除细胞碎片（低 FSC/SSC）和聚集体（高 FSC 且 SSC 变异大），可通过设门（Gating）仅采集单细胞群体。

  • 监测废液桶容量，避免满溢污染设备（建议每检测 5~10 个样本倾倒一次）。

• 异常处理：

  • 若出现 “液流中断” 报警，需检查鞘液是否不足、管路是否漏气或样本中有杂质，必要时用0.1% Triton X-100冲洗管路后重新校准。

  • 荧光信号突然降低时，检查激光器功率、滤光片位置或染色是否失效。

四、关机与维护

1. 关机流程

1. 清洗管路：

   • 检测结束后，用PBS 或专用清洗液冲洗进样针和管路（建议运行清洗程序 5~10 分钟），清除残留细胞和染料。

   • 若检测高浓度样本或黏性液体（如肿瘤组织裂解液），需先用3% 次氯酸钠溶液冲洗 3 分钟，再用超纯水冲洗干净。

2. 关闭系统：

   • 依次关闭激光器、主机电源、计算机，盖好仪器防尘罩。

   • 记录使用日志，包括开机时间、检测样本数、耗材更换情况等。

2. 日常维护要点

• 每日维护：

  • 更换废液桶，用 75% 乙醇擦拭进样针和样本架，避免交叉污染。

  • 检查鞘液剩余量，低于 1/3 时及时补充，确保次日正常运行。

• 每周维护：

  • 清洗鞘液桶和废液桶，用去离子水冲洗后干燥，避免微生物滋生。

  • 检查激光校准状态，用标准微球验证变异系数（CV 值应＜5%）。

• 每月维护：

  • 更换鞘液过滤膜（若为可更换式），清洗液流系统内部组件（需专业人员操作）。

  • 对光学元件（如透镜、滤光片）进行除尘，避免灰尘影响检测灵敏度。

五、安全与注意事项

1. 生物安全：

   • 处理感染性样本（如临床标本、病毒感染细胞）时，需在生物安全柜中操作，佩戴手套和护目镜，避免样本溅出。

   • 废液需经高压灭菌或含氯消毒剂处理后再丢弃，防止生物污染。

2. 激光安全：

   • 避免直视激光光源（尤其是紫外激光），操作时关闭仪器舱门，维修需由持证人员完成。

3. 耗材管理：

   • 使用专用样本管（如聚苯乙烯圆底管），避免使用玻璃管或带盖试管（可能导致进样针损坏）。

   • 荧光微球和抗体需避光保存于 4℃，避免反复冻融影响性能。

六、常见问题与解决策略

总结

流式细胞仪的操作需兼顾标准化流程与个性化调整，从样本制备到数据采集的每一个环节都会影响结果的准确性。定期维护设备、规范操作习惯，并结合软件数据分析（如设门策略、统计学分析），可最大限度发挥流式细胞仪在细胞分析、免疫分型、凋亡检测等领域的应用价值。新手需通过培训和反复实践积累经验，必要时参考仪器说明书或联系技术支持解决复杂问题。